高效液相色谱仪在进行多成分的复杂样品分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不*，后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰形较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。
在高效液相色谱仪中流速（压力）梯度洗脱和温度梯度洗脱效果不大，而且会带来一些不利影响，因此，高效液相色谱仪中的梯度洗脱通常指流动相梯度洗脱，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。
高效液相色谱仪梯度洗脱系统也称为梯度洗脱或程序洗脱。在相同的分析周期中，流动相的浓度比按一定的步骤不断变化，称为梯度洗脱。原理：流动相由几种不同极性的溶剂组成。通过改变流动相中溶剂的比例和改变流动相的极性，每个组分都有一个合适的容量系数k，样品中的所有组分都能在最短的时间内达到最佳的分离特性：提高柱效率和提高分离效率。检测灵敏度。敏感。当样品中某一峰的k‘值比上一峰高出几十至数百倍时，梯度洗脱效果特别好。在梯度洗脱过程中，必须采用恒流泵来保证流速的稳定性，否则很难得到重复的结果。
高效梯度液相色谱仪进行梯度洗脱时，选定溶剂A、B之后，设定梯度速度和梯度时间，确定梯度曲线形状，要以经济的梯度洗脱程序，实现样品的最佳化分离。影响梯度洗脱的因素有：
1、溶剂的纯度要高，否则会使梯度洗脱的重现性变坏。
2、梯度混合的溶剂互溶性要好，应防止不互溶的溶剂进入色谱柱。
3、注意溶剂的粘度和密度对混合流动相组成的影响。
4、梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择型检测器，而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器。
